ADC靶點方法學開發(fā)
▏ 什么是ADC藥物
ADC（Antibody-drug conjugate，ADC）藥物全稱為抗體偶聯(lián)藥物，是將抗體通過偶聯(lián)臂（Linker）與小分子藥物（Payload）共價連接的復合物。抗體負責靶向病灶，毒素通過自身特性殺傷目標細胞，連接子則是承擔橋接毒素和抗體直至ADC到達腫瘤細胞內(nèi)再進行釋放的功能。一個理想的ADC分子應該具備高靶點特異性、高腫瘤殺傷能力、長藥代特性、低免疫原性、低脫靶毒性。
圖1. ADC藥物的結(jié)構(gòu)圖示
▏ ADC藥物的作用機制
ADC藥物通過靜脈注射到血液中，隨著血液的流動，到達全身，但是科學家估計只有0.1%的ADC能到達患者的癌細胞。大部分會在循環(huán)系統(tǒng)和其他器官及組織中逐漸分解。到達癌細胞的ADC藥物一般是經(jīng)歷6個過程來起作用。
1. ADC藥物進入血液循環(huán)；
2. ADC藥物與癌細胞表面抗原結(jié)合；
3. ADC藥物通過受體介導的內(nèi)吞進入腫瘤細胞；
4. 溶酶體通過組織蛋白酶和纖溶酶降解ADC藥物；
5. 在癌細胞中釋放Payload，藥物結(jié)合到靶點蛋白；
6. 毒性分子誘導細胞凋亡，細胞破裂，同時部分ADC藥物也可能殺死周圍的癌細胞。
圖2. ADC藥物的作用機制模型
▏ ADC藥物活性評價平臺
1. ADC藥物與抗原結(jié)合能力檢測
1.1 bio-chemical assay
首先在生化水平(bio-chemical assay)上，可以采用ELISA的方式檢測ADC藥物與抗原的結(jié)合能力，常見的有Total Antibody ELISA、Conjugated Antibody ELIA、Conjugated drug ELISA。同樣的，針對PPI（Protein-Protein Interaction），biacore是一個強大的工具，可以得到更全面的動力學結(jié)合分析數(shù)據(jù)。
圖3. ELISA方法檢測ADC藥物和抗原靶點的結(jié)合
1.2 Cell-based assay
一般生化水平檢測完，就需要做細胞水平(Cell-based assay)的結(jié)合能力檢測,可以選擇靶點陽性的細胞來進行，一般可以同時選擇不表達、低表達、中表達、高表達的細胞一起做，檢測方法一般采用流式細胞術(shù)（FACS）來檢測。
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圖4. 科佰生物現(xiàn)貨腫瘤細胞庫組織分類示意圖
同時科佰構(gòu)建了300多株過表達ADC靶點的工程細胞株，全部是現(xiàn)貨供應，可以用于多種cell-based assay，比如ELISA、FACS、凋亡、增殖抑制等。
表1. 科佰生物部分現(xiàn)貨ADC靶點過表達工程細胞株列表
2. ADC藥物的ADCC/ADCP/CDC效應
ADC藥物中針對腫瘤相關(guān)抗原的抗體，同樣也會存在ADCC和ADCP效應。簡而言之，抗體的Fab端與腫瘤細胞結(jié)合，抗體的Fc端，會與效應細胞的FcγR結(jié)合，通過抗體連接腫瘤細胞和效應細胞，則效應細胞就可以釋放因子來殺死或者吞噬腫瘤細胞。
圖5. ADCC/ADCP/CDC原理示意圖
科佰生物開發(fā)了多種ADCC/ADCP的模型，采取的是報告基因的檢測方法，Luc的報告基因?qū)儆诨瘜W發(fā)光，是一種不需要激發(fā)光、本底噪音信號較低的方法學，靈敏度高，適用于ADC藥物的檢測。
| 貨號 | 模型名稱 | 應用 |
| CBP74002 | ADCC Bioassay Effector Cell F variant (Low Affinity)- Fcγ-NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74003 | ADCC Bioassay Effector Cell V variant (High Affinity)-Fcγ-NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74076 | Mouse ADCC Bioassay Effector Cell | Functional(Report Gene) Assay |
表2. 科佰生物現(xiàn)貨ADCC現(xiàn)貨工程細胞株
| 貨號 | 模型名稱 | 應用 |
| CBP74105 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIa -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74106 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (H variant) -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74004 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (R variant) -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
表3. 科佰生物現(xiàn)貨ADCP現(xiàn)貨工程細胞株
3. ADC藥物的內(nèi)吞
ADC藥物與腫瘤細胞表面的抗原結(jié)合后，會觸發(fā)受體介導的內(nèi)吞作用，ADC藥物被內(nèi)吞進入溶酶體中，溶酶體提供連接抗體和藥物的連接體裂解所需的酸性環(huán)境和酶，從而釋放細胞毒性有效載荷。常見的內(nèi)吞機制分為“ 網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用”和“不依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用”。
ADC藥物的內(nèi)吞作用是藥物起效的前提，內(nèi)吞動力學的研究能很好的幫助分析藥物的內(nèi)吞過程、內(nèi)吞效率、監(jiān)測有效載荷的釋放。經(jīng)典的內(nèi)吞動力學研究，多用酸性PH敏感的熒光染料來標記ADC抗體。一般而言，胞外的PH為7.4左右，細胞質(zhì)的PH為7.0-7.2左右，而進入溶酶體后，PH值會有明顯的下降，可以達到PH 4.7左右。在中性的環(huán)境下，沒有熒光，進入溶酶體，變成酸性環(huán)境后，PH敏感的熒光染料，就會發(fā)出熒光信號。
圖6. Incucyte系統(tǒng)，可以長期觀察多個時間點和濃度的細胞培養(yǎng)物
4. 載荷的毒性作用評價
ADC藥物從溶酶體中釋放有效載荷，這些載荷按照預期是可以殺死腫瘤細胞，常見的有效載荷分為幾類：
表4. 常見Payload的類型
4.1微管抑制劑(Microtubule Inhibitors):
這類載荷通過干擾細胞微管的正常功能，抑制細胞分裂和增殖。常見的微管抑制劑包括：
MMAE/MMAF:一類auristatin類化合物，通過抑制微管蛋白聚合發(fā)揮細胞毒性。
DM1/DM4:一類maytansinoid類化合物，同樣作用于微管蛋白。
4.2DNA損傷劑(DNA-damaging agents):
這類載荷通過損傷DNA，導致細胞死亡。常見的DNA損傷劑包括：
卡奇霉素(Calicheamicin):一種內(nèi)酯類抗生素，通過與DNA結(jié)合并產(chǎn)生自由基，導致DNA雙鏈斷裂。
吡咯并苯并二氮雜卓類(PBDs):通過與DNA小溝結(jié)合，導致DNA交聯(lián)，阻止DNA復制和轉(zhuǎn)錄。?
4.3 拓撲異構(gòu)酶抑制劑(Topoisomerase Inhibitors):
這類載荷通過抑制拓撲異構(gòu)酶的活性，影響DNA的復制和轉(zhuǎn)錄。常見的拓撲異構(gòu)酶抑制劑包括：
SN38/DXd:一類喜樹堿衍生物，是拓撲異構(gòu)酶I的抑制劑。
4.4 其他類型的載荷:
除了上述主要類別，還有一些其他類型的載荷正在開發(fā)中，例如：RNA聚合酶II抑制劑:通過抑制RNA聚合酶II的活性，影響RNA轉(zhuǎn)錄。其他新型細胞毒性藥物:例如杜卡霉素、PNU-159682、鵝膏蕈堿等。
不同的載荷有不同的作用機制和毒性特征，因此常見的評價有效載荷的毒性作用，我們可以采取細胞增殖抑制檢測、細胞凋亡檢測、細胞周期檢測等手段。
細胞增殖抑制檢測一般采用CTG、CCK8檢測藥物對腫瘤細胞增殖的抑制效果。以CTG為例，主要是檢測活細胞中的ATP，以熒光素酶的催化發(fā)光作為最終的讀數(shù)，是一種化學自發(fā)光的檢測，靈敏度高。
圖7. CTG法檢測ADC藥物的腫瘤細胞抑制
細胞凋亡檢測有很多方法，常見的有FACS檢測Annexin V/PI double staining、檢測Caspase、DNA碎片分析、TUNEL等，這些方法可以稱為是半定量，一般不適用于四參數(shù)擬合，計算藥效的EC50。
圖8. 通過檢測凋亡評定ADC藥物的毒性
有些ADC藥物的有效載荷是針對DNA復制相關(guān)的毒素，就會導致細胞周期的阻滯效果，比如Dxd毒素會導致細胞停滯在G2/M期。
圖9. 細胞周期分析ADC藥物有效載荷的作用
5. ADC藥物的旁觀者效應
旁觀者效應（Bystander efficacy）是指部分ADC藥物的有效載荷在釋放后可以滲透穿過細胞膜，進入到腫瘤微環(huán)境中，或者陽性細胞凋亡破裂后釋放有效載荷，滲透進入靶點陰性的腫瘤細胞并進行殺傷。
旁觀者效應在ADC藥物的殺傷作用中非常重要，一般用于評價旁觀者效應的體外藥效的方法有兩種：（1）共培養(yǎng)體系，（2）介質(zhì)轉(zhuǎn)移法。細胞共培養(yǎng)（co-culture)是將兩種細胞（抗原陽性Ag+、抗原陰性Ag-）混合共同培養(yǎng)，比較Ag-在共培養(yǎng)系統(tǒng)和單一培養(yǎng)系統(tǒng)中的活力，可以通過檢測腫瘤細胞的增殖抑制來比較。介質(zhì)轉(zhuǎn)移法是先用一定量的ADC處理Ag+細胞，一段時間后，將該介質(zhì)轉(zhuǎn)移到Ag-細胞。如果來自Ag+細胞的介質(zhì)對于Ag-比直接用同樣濃度的ADC處理體現(xiàn)出更好的殺傷效果，那么就可以說明具有旁觀者效應。
以下以共培養(yǎng)體系為例，介紹體外方法學的開發(fā)。
5.1 單一培養(yǎng)體系
因為ADC藥物的作用機制顯示，一來需要ADC藥物的抗原結(jié)合、內(nèi)吞、酶切，二來部分有效載荷是跟細胞周期有關(guān)，需要細胞積累阻滯，因此一般做旁觀者效應之前需要先摸索藥物的作用時間（一般建議至少2個倍增周期）和有效濃度，來確保對陽性細胞Ag+細胞的殺傷。
表5. 單一培養(yǎng)體系96孔板Layout設(shè)計
通過四參數(shù)擬合得到Ag+和Ag-細胞的殺傷曲線，計算出Ag+細胞的IC90，計算出Ag-細胞的IC50，注意這里建議藥物的濃度建議使用有效載荷濃度（非ADC藥物濃度）來做數(shù)據(jù)擬合。在下一步的細胞共培養(yǎng)體系中，可以選擇大于Ag+細胞IC90、同時小于Ag-細胞的IC50的濃度，來測試旁觀者效應。
5.2 共培養(yǎng)體系
在做共培養(yǎng)之前，我們需要明確幾點：
① 最好Ag-細胞帶Luc的標記，這樣屆時檢測時，只要針對Luc做信號檢測即可；
② 因為Ag-的殺傷來自于Ag+細胞的殺傷釋放，因此需要摸索不同的Ag+和Ag-共培養(yǎng)的細胞比例關(guān)系；
③ 旁觀者效應需要的時間更長，如果細胞培養(yǎng)中，涉及添液（不可換液）的操作，則會稀釋毒素的濃度，進而影響對Ag-細胞的殺傷；
④ 實驗中有各種因素會影響到這種長周期的細胞增殖抑制實驗，因此我們一般是通過與Ag-單一細胞模型比較來判斷是否存在旁觀者效應。
常見的設(shè)計如下：
表6. 共培養(yǎng)體系96孔板Layout設(shè)計
6. 體內(nèi)藥效評價
體內(nèi)評價ADC藥物的活性，可以將細胞接種到小鼠上，做CDX模型。通過小鼠的皮下瘤、原位瘤的變化來檢測ADC藥物的藥效。同時如果做旁觀者效應的話，可以在Ag-的細胞上做Luc的標記，用活體動物成像來檢測瘤的變化。
科佰生物提供3類細胞產(chǎn)品助力體內(nèi)的藥效評價，除了1.2中提供的1500多株腫瘤細胞、300多株過表達的工程細胞外，還提供160多種Luc標記的示蹤細胞，在接種皮下瘤時，可以通過活體成像來檢測瘤子的變化。
表7. 科佰生物部分現(xiàn)貨示蹤Luc細胞的清單展示
▏ 總結(jié)
中國藥企在ADC等領(lǐng)域經(jīng)過多年技術(shù)沉淀后，已具備開發(fā)first in class（FIC）突破性療法的實力，并且能夠在新興賽道上擔當全球先鋒。回顧過去，國內(nèi)獲批的ADC藥物更多是fast-follow策略下的成功實踐，這類藥物也在海外市場獲得了一定認可，吃到了一波出海紅利，落地了大量BD交易，為國內(nèi)創(chuàng)新藥出海積累了寶貴經(jīng)驗。
表8. 本文思路總結(jié)
